分享正确培养猪胚胎细胞的流程
大家都知道胚胎干细胞是从囊胚内的细胞团内分离出来的,具备更新及分化为3寸囊胚层及生殖细胞的功效,进行分离机培养体系会影响雌胚胎的体内胚胎的基因,因而导致干细胞的成活率及整体质量标准。
分享正确培养猪胚胎细胞的流程

准备工作:首先是收集猪卵巢,保存在含有青链霉素的生理盐水中,运输过程中温度是32-38摄氏度,3h内运回实验室,采用的方法是抽吸法采集卵巢卵母细胞,抽取3-6mm卵母细胞置于15ml离心管中,在37摄氏度的水浴内静置后,等到等到卵母细胞沉降后,用洗卵液洗2次,然后借助显微镜挑取颗粒细胞层达到3层以上的卵丘卵母细胞复合物,然后将cocs转入U型皿中进行培养44h,每个孔加500ul成熟培养液,每个孔放置50-70枚。

体内胚胎收集方法:从人工授精的母猪体内收集第7-8d的囊胚,每天监测母猪的发情,将日期作为0天,鉴定后6/12及18h后进行人工授精,从子宫冲洗胚胎时使用预热的10%磷酸缓冲盐溶液。

猪胚胎分类多能干细胞:将去除透明袋的囊胚接种到丝裂素处理过的胚胎纤维细胞饲养层上2-4d,囊胚在细胞团内在3-5d后出现,等到IMC适中的时候,用机械法分离细胞,重铺到新的饲养层上,使用不同的猪胚胎干细胞培养基上,胚胎干细胞克隆每5-7d采用机械法传代。

细胞培养:用利用核移植供体的猪胎儿成纤维细胞从初生猪仔的耳部进行分离,细胞培养基为DMEM,15%胎牛血清,培养温度是37摄氏度,然后用0.25%的胰蛋白酶消化,中和后离心,将细胞重悬后并加入等量冻存液(40%DMEM,40%FBS和20%DMSO),贮存在低温液氮罐内的液氮中。

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